本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2(以下簡(jiǎn)稱AFTB1、AFTB2、AFTG1和AFTG2)的測(cè)定方法。第一法為同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,適用于AFTB1、AFTB2、AFTG1和AFTG2的測(cè)定。第二法為高效液相色譜-柱前衍生法,適用于AFTB1、AFTB2、AFT G1和AFT G2的測(cè)定。第三法為高效液相色譜-柱后衍生法,適用于AFTB1、AFTB2、AFT G1和AFT G2的測(cè)定。第四法為酶聯(lián)免疫吸附篩查法,適用于AFTB1的測(cè)定。（點(diǎn)擊圖片查看標(biāo)準(zhǔn)詳情）
第一法 同位素稀釋液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法
原理:試樣中的黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2,用乙睛水溶液或甲醇-水溶液提取,提取液用含1%TritonX-100(或吐溫-20)的磷酸鹽緩沖溶液稀釋后(必要時(shí)經(jīng)黃曲霉毒素固相凈化柱初步凈化),通過(guò)免疫親和柱凈化和富集,凈化液濃縮、定容和過(guò)濾后經(jīng)液相色譜分離,串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)，同位素內(nèi)標(biāo)法定量。
| 乙腈 |
| CH3CN，色譜純 |
| 甲醇 |
| CH3OH，色譜純 |
| 水 |
| 為GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水 |
| 乙酸銨 |
| CH3COONH4，色譜純 |
| 氯化鈉 |
| NaCl，分析純 |
| 冰箱 |
| -20℃ |
| 容量瓶 |
| 100 mL |
| 容量瓶 |
| 10 mL |
| 吐溫-20 |
| C58H114O26 |
| 試劑瓶 |
| – |
| 黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液 |
| AFTB1，10μg/mL |
| 黃曲霉素B1-13C17標(biāo)準(zhǔn)溶液 |
| 0.5μg/mL |
| 磷酸氫二鈉 |
| Na2HPO4，分析純 |
| 磷酸二氫鉀 |
| KH2PO4，分析純 |
| 氯化鉀 |
| KCl，分析純 |
| 鹽酸 |
| HCl，分析純 |
| TritonX-100 |
| [C14H22O(C2H4O)n]，或吐溫-20,C58H114O26 |
| 黃曲霉毒素B1 |
| AFT B1，C17H12O6,CAS:1162-65-8，純度≥98%,或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) |
| 黃曲霉毒素B2 |
| AFT B2，C17H14O6,CAS:7220-81-7，純度≥98%,或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) |
| 黃曲霉毒素G1 |
| AFT G1,C17H12O7,CAS:1165-39-5，純度≥98%,或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) |
| 黃曲霉毒素G2 |
| AFT G2，C17H14O7,CAS:7241-98-7，純度≥98%,或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) |
| 黃曲霉素B1-13C17 |
| 13C17-AFT B1，同位素內(nèi)標(biāo),C17H12O6,CAS:157449-45-0，純度≥98%,濃度為0.5μg/mL |
| 黃曲霉毒素B2-13C17 |
| 13C17-AFT B2,同位素內(nèi)標(biāo),C17H14O6,CAS:157470-98-8，純度≥98%,濃度為0.5μg/mL |
| 黃曲霉毒素G1-13C17 |
| 13C17-AFT G1，同位素內(nèi)標(biāo),C17H12O7,CAS:157444-07-9，純度≥98%,濃度為0.5μg/mL |
| 黃曲霉毒素G2-13C17 |
| 13C17-AFT G2,同位素內(nèi)標(biāo),C17H14O7,CAS:157462-49-7，純度≥98%,濃度為0.5μg/mL |
| 勻漿機(jī) |
| – |
| 搗碎機(jī) |
| 組織搗碎機(jī) |
| 粉碎機(jī) |
| 高速 |
| 振蕩器 |
| 超聲波/渦旋振蕩器或搖床 |
| 天平 |
| 感量0.01g和0.00001g |
| 渦旋混勻器 |
| 渦旋混合器 |
| 均質(zhì)器 |
| 高速,轉(zhuǎn)速6500r/min~24000r/min |
| 離心機(jī) |
| 轉(zhuǎn)速≥6000r/min |
| 濾紙 |
| 玻璃纖維濾紙,快速、高載量、液體中顆粒保留1.6μm |
| 固相萃取裝置 |
| 帶真空泵 |
| 氮吹儀 |
| – |
| 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀 |
| 帶電噴霧離子源 |
| 免疫親和柱 |
| AFTB1柱容量≥200ng,AFTB1柱回收率≥80%,AFTG2的交叉反應(yīng)率≥80%(驗(yàn)證方法參見(jiàn)附錄B) |
| 固相萃取柱 |
| 黃曲霉毒素專用型，或功能相當(dāng)?shù)墓滔噍腿≈?，以下?jiǎn)稱凈化柱):對(duì)復(fù)雜基質(zhì)樣品測(cè)定時(shí)使用 |
| 過(guò)濾器 |
| 微孔濾頭,帶0.22μm微孔濾膜(所選用濾膜應(yīng)采用標(biāo)準(zhǔn)溶液檢驗(yàn)確認(rèn)無(wú)吸附現(xiàn)象,方可使用) |
| 樣品篩 |
| 篩網(wǎng)，1mm~2mm試驗(yàn)篩孔徑 |
| 酸度計(jì) |
| pH計(jì) |
| 離心管 |
| 50ml |
| 液相色譜柱 |
| C18柱(柱長(zhǎng)100mm,柱內(nèi)徑2.1mm;填料粒徑1.7μm),或相當(dāng)者 |
| 注射器 |
| 150mL |
| 泵 |
| 真空泵 |
| 試管 |
| 10ml刻度 |
| 氮?dú)?/td> |
| – |
| 移液管 |
| 刻度 |
| 樣品瓶 |
| 進(jìn)樣瓶 |
第二法 高效液相色譜—柱前衍生法
原理:試樣中的黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2,用乙腈-水溶液或甲醇-水溶液的混合溶液提取,提取液經(jīng)黃曲霉毒素固相凈化柱凈化去除脂肪,蛋白質(zhì)、色素及碳水化合物等干擾物質(zhì),凈化液用三氟乙酸柱前衍生,液相色諧分離.熒光檢測(cè)器檢測(cè).外標(biāo)法定量。
| 水 |
| GB/T 6682 規(guī)定的一級(jí)水 |
| 甲醇 |
| CH3OH，色譜純 |
| 乙腈 |
| CH3CN，色譜純 |
| 冰箱 |
| -20℃ |
| 容量瓶 |
| 100ml |
| 容量瓶 |
| 10 mL |
| 試劑瓶 |
| – |
| 振蕩器 |
| 渦旋振蕩器 |
| 搖床 |
| – |
| 黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液 |
| AFTB1 |
| 正己烷 |
| C6H14，色譜純 |
| 三氟乙酸 |
| CF3COOH，分析純 |
| 黃曲霉毒素B1 |
| AFT B1，C17H12O6,CAS:1162-65-8，純度≥98%,或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) |
| 黃曲霉毒素B2 |
| AFT B2，C17H14O6,CAS:7220-81-7，純度≥98%,或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) |
| 黃曲霉毒素G1 |
| AFT G1,C17H12O7,CAS:1165-39-5，純度≥98%,或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) |
| 黃曲霉毒素G2 |
| AFT G2，C17H14O7,CAS:7241-98-7，純度≥98%,或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) |
| 勻漿機(jī) |
| – |
| 粉碎機(jī) |
| 高速 |
| 搗碎機(jī) |
| 組織搗碎機(jī) |
| 超聲波清洗器 |
| 超聲波/渦旋振蕩器或搖床 |
| 離心管 |
| 50 mL |
| 天平 |
| 感量0.01g和0.00001g |
| 渦旋混勻器 |
| 渦旋混合器 |
| 均質(zhì)器 |
| 高速均質(zhì)器,轉(zhuǎn)速6500r/min~24000r/min |
| 離心機(jī) |
| 轉(zhuǎn)速≥6000r/min |
| 濾紙 |
| 玻璃纖維濾紙,快速、高載量、液體中顆粒保留1.6μm |
| 氮吹儀 |
| – |
| 液相色譜儀 |
| 配熒光檢測(cè)器 |
| 固相萃取柱 |
| 黃曲霉毒素專用型，以下簡(jiǎn)稱凈化柱,或相當(dāng)者 |
| 過(guò)濾器 |
| 一次性微孔濾頭,帶0.22μm微孔濾膜(所選用濾膜應(yīng)采用標(biāo)準(zhǔn)溶液檢驗(yàn)確認(rèn)無(wú)吸附現(xiàn)象,方可使用) |
| 樣品篩 |
| 篩網(wǎng)，1mm~2mm試驗(yàn)篩孔徑 |
| 恒溫箱 |
| – |
| 酸度計(jì) |
| pH計(jì) |
| 氮?dú)?/td> |
| – |
| 樣品瓶 |
| 進(jìn)樣瓶 |
| 液相色譜柱 |
| C18柱(柱長(zhǎng)150mm或250mm,柱內(nèi)徑4.6mm,填料粒徑5.0μm),或相當(dāng)者 |
第三法 高效液相色譜—柱后衍生法
原理:試樣中的黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2,用乙腈-水溶液或甲醇-水溶液的混合溶液提取,提取液經(jīng)免疫親和柱凈化和富集,凈化液濃縮、定容和過(guò)濾后經(jīng)液相色譜分離,柱后衍生(碘或溴試劑衍生、光化學(xué)衍生.電化學(xué)衍生等),經(jīng)熒光檢測(cè)器檢測(cè),外標(biāo)法定量.
| 甲醇 |
| CH3OH，色譜純 |
| 乙腈 |
| CH3CN，色譜純 |
| 硝酸 |
| 濃硝酸,電化學(xué)衍生劑,HNO3 |
| 濾膜 |
| 0.45 um |
| 氯化鈉 |
| NaCl，分析純 |
| 磷酸氫二鈉 |
| Na2HPO4，分析純 |
| 磷酸二氫鉀 |
| KH2PO4，分析純 |
| 氯化鉀 |
| KCl，分析純 |
| 鹽酸 |
| HCl，分析純 |
| TritonX-100 |
| [C14H22O(C2H4O)n](或吐溫-20,C58H114O26) |
| 碘 |
| I2，分析純 |
| 三溴化吡啶 |
| 溴衍生使用試劑,C5H6Br3N2 |
| 溴化鉀 |
| 電化學(xué)衍生使用試劑,KBr |
| 水 |
| 為GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水 |
| 黃曲霉毒素B1 |
| AFT B1，C17H12O6,CAS:1162-65-8，純度≥98%,或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) |
| 黃曲霉毒素B2 |
| AFT B2，C17H14O6,CAS:7220-81-7，純度≥98%,或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) |
| 黃曲霉毒素G1 |
| AFT G1,C17H12O7,CAS:1165-39-5，純度≥98%,或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) |
| 黃曲霉毒素G2 |
| AFT G2，C17H14O7,CAS:7241-98-7，純度≥98%,或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) |
| 冰箱 |
| -20℃ |
| 容量瓶 |
| 100 mL |
| 容量瓶 |
| 10 mL |
| 振蕩器 |
| 渦旋振蕩器 |
| 搖床 |
| – |
| 勻漿機(jī) |
| – |
| 粉碎機(jī) |
| 高速 |
| 搗碎機(jī) |
| 組織搗碎機(jī) |
| 超聲波清洗器 |
| – |
| 天平 |
| 感量0.01g和0.00001g |
| 渦旋混勻器 |
| 渦旋混合器 |
| 均質(zhì)器 |
| 高速,轉(zhuǎn)速6500r/min~24000r/min |
| 離心機(jī) |
| 轉(zhuǎn)速≥6000r/min |
| 濾紙 |
| 玻璃纖維濾紙,快速、高載量、液體中顆粒保留1.6μm |
| 固相萃取裝置 |
| 帶真空泵 |
| 氮吹儀 |
| – |
| 液相色譜儀 |
| 配熒光檢測(cè)器(帶一般體積流動(dòng)池或者大體積流通池) |
| 柱后衍生裝置 |
| 光化學(xué)柱后衍生器,適用于光化學(xué)柱后衍生法 |
| 柱后衍生裝置 |
| 溶劑柱后衍生裝置,適用于碘或溴試劑衍生法 |
| 柱后衍生裝置 |
| 電化學(xué)柱后衍生器,適用于電化學(xué)柱后衍生法 |
| 免疫親和柱 |
| AFTB1柱容量≥200ng,AFTB1柱回收率≥80%,AFTG2的交叉反應(yīng)率≥80% |
| 固相萃取柱 |
| 黃曲霉毒素固相凈化柱或功能相當(dāng)?shù)墓滔噍腿≈?以下簡(jiǎn)稱凈化柱):對(duì)復(fù)雜基質(zhì)樣品測(cè)定時(shí)使用 |
| 過(guò)濾器 |
| 一次性微孔濾頭,帶0.22μm微孔濾膜(所選用濾膜應(yīng)采用標(biāo)準(zhǔn)溶液檢驗(yàn)確認(rèn)無(wú)吸附現(xiàn)象,方可使用) |
| 樣品篩 |
| 篩網(wǎng)，1mm~2mm試驗(yàn)篩孔徑 |
| 注射器 |
| 50mL |
| 泵 |
| 真空泵 |
| 氮?dú)?/td> |
| – |
| 移液管 |
| 刻度 |
| 樣品瓶 |
| 進(jìn)樣瓶 |
| 液相色譜柱 |
| C18柱(柱長(zhǎng)150mm或250mm,柱內(nèi)徑4.6mm,填料粒徑5μm),或相當(dāng)者 |
| 液相色譜柱 |
| C18柱(柱長(zhǎng)100mm,柱內(nèi)徑2.1mm,填料粒徑1.7μm),或相當(dāng)者 |
| 液相色譜柱 |
| C18柱(柱長(zhǎng)100mm或250mm,柱內(nèi)徑4.6mm,填料粒徑5μm),或相當(dāng)者 |
| 液相色譜柱 |
| C18柱(柱長(zhǎng)100mm或250mm,柱內(nèi)徑4.6mm,填料粒徑5μm),或相當(dāng)者 |
| 液相色譜柱 |
| C18柱(柱長(zhǎng)100mm或250mm,柱內(nèi)徑4.6mm,填料粒徑5μm),或相當(dāng)者 |
| 聚醚醚酮管 |
| PEEK管,長(zhǎng)充50cm,內(nèi)徑0.5mm |
第四法 酶聯(lián)免疫吸附篩查法
原理:試樣中的黃曲霉毒素B1用甲醇水溶液提取,經(jīng)均質(zhì)、渦旋、離心(過(guò)濾)等處理獲取上清液。被辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記或固定在反應(yīng)孔中的黃曲霉毒素B,與試樣上清液或標(biāo)準(zhǔn)品中的黃曲霉毒素B1,競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合特異性抗體。在洗滌后加入相應(yīng)顯色劑顯色,經(jīng)無(wú)機(jī)酸終止反應(yīng),于450nm或630nm波長(zhǎng)下檢測(cè)。樣品中的黃曲霉毒素B1與吸光度在一定濃度范圍內(nèi)呈反比。
| 酶標(biāo)儀 |
| 微孔板酶標(biāo)儀，帶450nm與630nm(可選)濾光片 |
| 研磨機(jī) |
| – |
| 水 |
| GB/T 6682 規(guī)定二級(jí)水 |
| 振蕩器 |
| – |
| 天平 |
| 電子天平,感量0.01g |
| 離心管 |
| 50 mL |
| 酶聯(lián)免疫試劑盒 |
| – |
| 離心機(jī) |
| 轉(zhuǎn)速≥6000r/min |
| 濾紙 |
| 快速定量濾紙,孔徑11μm |
| 樣品篩 |
| 篩網(wǎng)，1mm~2mm孔徑 |
第五法 薄層色譜法
原理:樣品經(jīng)提取、濃縮、薄層分離后,黃曲霉毒素B1在紫外光(波長(zhǎng)365 nm)下產(chǎn)生藍(lán)紫色熒光，根據(jù)其在薄層上顯示熒光的最低檢出量來(lái)測(cè)定含量.
| 甲醇 |
| CH3OH，分析純 |
| 正己烷 |
| C6H14，分析純 |
| 水 |
| GB/T 6682 規(guī)定的一級(jí)水 |
| 漂白粉 |
| – |
| 碳酸鈉 |
| 工業(yè)用,Na2CO3·10H2O |
| 石油醚 |
| 沸程30℃~60℃或60℃~90℃ |
| 三氯甲烷 |
| CHCl3，分析純 |
| 苯 |
| C6H6，分析純 |
| 乙腈 |
| CH3CN，分析純 |
| 乙醚 |
| 無(wú)水乙醚,C2H6O，分析純 |
| 丙酮 |
| C3H6O，分析純 |
| 硅膠 |
| 硅膠G,薄層層析用 |
| 三氟乙酸 |
| CF3COOH，分析純 |
| 硫酸鈉 |
| 無(wú)水硫酸鈉,Na2SO4，分析純 |
| 氯化鈉 |
| NaCl，分析純 |
| 冰箱 |
| 4℃ |
| 容量瓶 |
| 10 mL |
| 容量瓶 |
| 5mL |
| 錐形瓶 |
| 250 mL具塞 |
| 濾紙 |
| 快速定性濾紙 |
| 分液漏斗 |
| – |
| 黃曲霉毒素B1 |
| AFT B1，C17H12O6,CAS:1162-65-8，純度≥98%,或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) |
| 樣品篩 |
| 圓孔篩，2.0mm篩孔孔徑 |
| 粉碎機(jī) |
| 小型粉碎機(jī) |
| 振蕩器 |
| 電動(dòng)振蕩器 |
| 蒸餾裝置 |
| 全玻璃濃縮器 |
| 薄層板 |
| 玻璃板,5cm×20cm |
| 薄層板涂布器 |
| – |
| 展開(kāi)缸 |
| 展開(kāi)槽,長(zhǎng)25cm,寬6cm,高4cm |
| 紫外燈 |
| 100W~125W,帶365nm濾光片 |
| 注射器 |
| 微量注射器或血色素吸管 |
| 燒杯 |
| – |
| 干燥器 |
| – |
| 濾紙 |
| 定量慢速濾紙 |
| 蒸發(fā)皿 |
| 50 mL |
| 通風(fēng)柜 |
| – |
| 滴管 |
| 帶橡皮頭 |
| 試管 |
| 2mL具塞 |
| 錐形瓶 |
| 100mL具塞 |
| 吹風(fēng)機(jī) |
| 冷風(fēng) |
| 支架 |
| 玻璃支架 |
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